体外培养人牙周膜细胞方法的探讨

　目的： 研究如何提高体外培养人牙周膜细胞（hPDL）的成功率，为简便、快速地获得大量成活率高的hPDL膜细胞，建立体外细胞模型提供一定的实验方法。方法： 利用3种不同方法（组织块法、酶消化组织块法、全牙消化法）进行牙周膜细胞的原代培养，用形态学、免疫细胞化学染色等方法鉴定细胞来源；通过生长曲线的测定研究体外细胞生长特性。结果： 3种方法获得的细胞形态和生物学行为大致相同；波丝蛋白抗体染色阳性，角蛋白抗体染色阴性。组织块法培养的细胞同源性好，但初代培养时间长；全牙消化法的原代培养成功率高于其他2种方法。结论： 通过对牙周膜细胞培养方法的改良，可以显著提高hPDL原代培养的成功率。

【关键词】  牙周膜； 细胞培养； 免疫组织化学

　　［Abstract］ Objective: To establish a simple, fast, and efficient technique for human periodontal ligament （hPDL） cell in vitro cultivation with higher success rate. Methord: Primary hPDL cells were cultured using three different methods （tissue explant, explant with enzymatic digestion, and tooth enzymatic digestion）. Morphological analysis and immunocytochemical staining were used to characterize the cell lineage, and growth curve assay was adopted to evaluate the biological features of hPDL cells. Results: Morphological and biological characteristics of cells cultured with the 3 kinds of method were similar. They were spindle-shaped, and showed positive reaction to antibodies against vimentin, and negative reaction to antibodies against keratin. Cells obtained with tissue explant showed better homology, but need longer culture time; The success rate of primary hPDL cell culture in tooth enzymatic digestion group was significantly higher than those in the other 2 groups. Conclusion: By making improvement in specimen collecting and culturing methods, the success rate of primary culture of hPDL cells can be noticeably increased.

　　［Key words］ periodontal ligament; cell culture; immunohistochemistry

    细胞体外分离培养是研究复杂的生物系统的重要手段，细胞培养条件下，将细胞从复杂的体内环境转移到较为简单的体外环境，可对细胞学研究中的变量进行分离和控制。上世纪70年代以来，国外学者对牙周膜细胞（Periodontal LigamentCells PDL）分离纯化进行了大量的探索和研究，且成功地从猴、猪、人等牙周膜分离培养出牙周膜细胞［1～3］。人牙周膜细胞（hPDL）分离培养主要有酶消化法和组织贴块法［4］。国内外学者对这2种方法评价不一，并且在这2种方法的基础上进行改进提出了酶消化组织块法和全牙消化法［5］。对组织块法、酶消化组织块法和全牙消化法这3种方法做了一些比较，以寻求hPDL体外培养的最佳方法。

　　1  材料和方法

　　1.1  试剂及主要实验仪器设备

　　α-MEM 培养液（Hyclone，USA），胶原酶（Type I，Sigma，USA），胎牛血清（杭州四季青），胰蛋白酶（配成0.25 %,过滤分装，冷冻保存），青霉素 100 U/ml，链霉素 100 mg/L；SABC 免疫组织化学试剂盒（武汉博士德），角蛋白抗体及波丝蛋白抗体（武汉博士德），二氧化碳恒温培养箱，倒置相差显微镜，血球计数板。

　　1.2  方法

　　1.2.1  组织块法培养hPDL

　　（1）取材：选择健康青少年（12～18 岁）正畸拔除的健康的双尖牙，超净工作台内用刀片仔细刮除附着牙龈及根尖组织，用 D-Hanks液冲洗 3 次；（2）无菌处理：将牙冠浸入 5.25%次氯酸钠溶液中 2 min，再用含高浓度双抗的D-Haks液冲洗2遍。按照司徒镇强［6］传统组织块培养法进行原代培养；（3）传代：细胞汇合至培养瓶 80%时，用0.25%的胰蛋白酶消化液1∶2消化传代。

　　1.2.2  酶消化组织块法培养hPDL

　　酶消化组织块法原代培养在取材、无菌处理上与组织块法相同。刮下根中 2/3 的牙周膜后，不剪，移入离心管内。0.1%胶原酶37 ℃消化30 min，其中，每5 min振荡1次，当肉眼观察到培养液略混浊，显微镜下见组织块松散时，离心，弃上清液，用含血清及双抗的培养基漂洗1次后弃上清液，收集组织块，将组织块平铺于培养瓶底，翻转培养瓶，向内加入 4 ml 培养液，置CO2培养箱孵育2 h，使组织块贴壁，再翻转培养瓶培养；传代与组织块法相同。

　　1.2.3  全牙消化法培养hPDL

　　全牙消化法原代培养牙周膜细胞取材、无菌处理与组织块法相同。将牙齿放入装有0.1%胶原酶的青霉素小瓶内，牙根向下，使消化液浸没牙根，37 ℃温箱内消化1 h，用吸管充分吹打牙根表面，加入等量含血清的培养基，离心，弃上清液，加入3 ml培养基（含10%胎牛血清、青霉素 100 U/ml、链霉素 100 mg/L）吹打形成细胞悬液，移入25 ml培养瓶内，置CO2培养箱内进行培养，3 d换液1次，待细胞铺至瓶底80%时用0.25%胰蛋白酶1∶2消化传代。

　　1.3  细胞的生长情况观察

　　1.3.1  倒置相差显微镜连续观察细胞原代和传代生长情况。
　　
　　1.3.2  HE染色

　　取生长状态良好的第5代细胞进行爬片，用苏木精-伊红染色，观察细胞形态。

　　1.3.3  细胞免疫化学染色

　　将培养的第3代hPDL接种于置有盖玻片的培养瓶中，按常规 SABC 法操作，进行波丝蛋白抗体、角蛋白抗体染色，光镜下观察染色情况。

　　1.3.4  描绘细胞生长曲线

　　取3块 24 孔板，分别取3种方法培养的第5代细胞，调整细胞浓度为1×104个/ml接种于 24 孔板，每孔100 μl，CO2培养箱内培养4 h后每孔加0.5 ml培养液继续培养，每天每组各取 3孔的细胞作细胞计数，连续观察8 d，绘制细胞生长曲线。
 
　　2  结果

　　2.1  形态学观察3种方法培养的hPDL形态学上无太大区别，均呈长梭形或星形，胞突细长，胞体丰满，胞浆均匀，中央有圆形或椭圆型的胞核，细胞呈放射状、漩涡状排列（见图1～3）。HE 染色胞核嗜碱性，胞浆嗜伊红 （见图4）。
 
　　2.2  免疫组织化学鉴定结果免疫组织化学实验显示细胞波形丝蛋白染色阳性，角蛋白染色阴性，证明为中胚层组织来源（见图5、图6）。

　　2.3  3种方法培养的hPDL生长情况
2.3.1  组织块法

　　牙周膜组织块经静置贴壁后，一般 8～16 d组织块边缘有细胞开始游出，以组织块为中心成放射状、漩涡状生长，生长的细胞以1∶2 传代培养，最初5代的细胞3～5 d即可长满培养瓶底，生长状态较活跃，核分裂相多见；6～12 代细胞，7～10 d汇合，细胞增殖稳定。本实验用组织块法培养牙周膜细胞培养了20例，成功1例，成功率5%。

　　2.3.2  酶消化组织块法

　　用此方法所培养的20例中，有4例在5～10 d内观察到细胞游出，2例传代成功。细胞以组织块为中心呈放射状排列生长。传代后的细胞生长旺盛，状态良好，原代培养成功率为10%。图1  组织块周围长出的牙周膜         
　　2.3.3  全牙消化法

　　最初消化下来的细胞为圆形，呈悬浮状态。24 h 后细胞开始贴壁，48 h 后几乎全部贴壁。贴壁后的细胞2～3 d开始伸展变形，多数细胞形态呈长梭形或星形，少数呈扁平多角形。从第6天起，细胞生长加速，长梭形及星形细胞增殖活跃，多角形细胞生长相对较缓慢，细胞大约经历12 d后开始形成单层，长梭形细胞占绝对优势。细胞传至 2～3代时可基本去除上皮样细胞，4～10 代细胞生长状态较好，核分裂相多见，3～5 d可长满培养瓶底。用此方法原代培养20例，有4例传代成功，成功率20%。

　　2.4  细胞增殖情况及生长曲线从第5代牙周膜细胞的增殖数和生长曲线可以看出，3种方法培养的细胞增殖速度相近，生长曲线相似，均呈S型（见图7）。

　　3  讨论   

　　原代培养是从供体获取组织后首次培养，主要应用酶消化法和组织块培养法，这2种方法在国内外均有人采用，而且采用的组织比较广泛，迄今为止，人们相继利用猪、猴、牛等多种动物和人的拔除牙齿来培养牙周膜细胞［1～3］。国内学者多采用组织块法。上世纪70年代初，Arnold首先系统研究了组织块法培养PDL和其生长特点［7］。国内在这方面的研究起步较晚，最初在上世纪90年代报道了用组织块法培养hPDL，目前对培养的方法正在不断完善和改进［8］。　　

　　本实验采用3种方法对PDL原代培养，其中，组织块法培养的hPDL，原代培养时间较长，细胞传代显示，最初5代的细胞 3～5 d即可长满培养瓶底，生长状态较活跃，分裂相多见；6～12代细胞，7～10 d汇合，细胞增殖稳定，可为实验提供足量的细胞，适于进行细胞形态、功能、生理、生物化学、分子生物学等多方面的实验。12～20代，细胞 10～15 d长满瓶底，细胞增殖速度下降，营养状况不佳，胞浆内出现颗粒和空泡，细胞趋于老化。虽然这种方法原代培养操作简便，细胞同源性好，但并非每块组织都有生长能力，组织块法原代培养成功率5%，培养的成活率较低，到可传代的时间较长。 

　　酶消化组织块法，即将不经切割的牙周膜先用酶消化使组织略松散，进行培养。在实际操作中发现，从根中2/3刮取到的牙周组织块已经较小，为了最大限度地利用组织，减小损伤，将不经切割的牙周膜直接用酶消化，以去除部分妨碍细胞生长的基质和纤维［9］。此种方法虽然减少了牙周膜被反复剪切而导致组织块的损伤，但刮取的过程中对牙周膜组织已经造成了机械性损伤，组织块成活率也较低，本实验成活率为10%。 

　　利用全牙消化法可减少刮取组织块时的机械损伤，最初消化下来的细胞为圆形，呈悬浮状态。24 h 后圆形细胞开始贴壁，48 h 后几乎全部贴壁。贴壁后的细胞伸展变形较慢，约贴壁后2～3 d开始伸展变形，多数细胞形态呈长梭形或星形，少数呈扁平多角形。从第6天起，细胞生长加速，长梭形及星形细胞增殖活跃，多角形细胞生长相对较缓慢，细胞大约经历12 d后开始形成单层，长梭形细胞占绝对优势。细胞传至 2～3代时可基本去除上皮样细胞，4～10 代细胞生长状态较好，核分裂相多见，3～5 d可长满培养瓶底；本实验用此方法成功率20%。

　　3种方法培养的hPDL经稳定传代后均为长梭形成纤维细胞，免疫组织化学实验显示，细胞角蛋白染色阴性，波形丝蛋白染色阳性，说明传代培养的细胞均来自中胚层的成纤维细胞。细胞经稳定传代后，细胞的增殖速度相近，生长曲线很相似，说明细胞的生长特性无太大区别。通过对3种培养方法的比较发现，除细胞的初代培养时间和细胞纯化程度3种方法差别较大之外，细胞的其他特性无明显区别。实际应用中，组织块法培养hPDL适用于细胞纯度要求较高的实验，而全牙消化法培养hPDL适用于短期内获得大量细胞的实验；因本实验例数较少以及实验条件等原因，对体外培养hPDL的最佳实验方法仍需作进一步的探索及改进。

【参考文献】
  　　［1］Arnold LF, Baram P. In vitro culture of periodontal ligament cells［J］. Dent Res,1972（4）:953-959.

　　［2］Brunette DM, Kanoza RJ, Marmary Y, et al. Interactions betweenepithelial and fibroblast-like cells in cultures derived from monkeyperiodontal ligament［J］. Cell Sci,1977（27）:127-130.

　　［3］Huard TK, Arnold LF, Baram P. Cultivation of periodontal ligament fibroblasts on dental implant materials and enzymatically debrided teeth［J］.Dent Res,1974（6）:1368-1376.

　　［4］Ragnarsson B, Carr C, Daniel JC. Isolation and growth of human periodontal ligament cells in vitr［J］. Dent Res,1985（64）:1026-1030.

　　［5］王健平,隋晓梅.组织块法和酶消化法培养人牙周膜细胞［J］.黑龙江医药科学,2002（6）:4-6.

　　［6］司徒镇强,吴军正.细胞培养［M］.西安:世界图书出版公司西安公司,1996.63-71.

　　［7］Adams AM, Soames JV, Seral RF.Cultural and morphological characteristics of human periodontal ligament cells in vitro［J］. Arch Oral Biol, 1993（38）:657-662.

　　［8］赵桂芝,吴军正,陈建元.人牙周膜成纤维细胞的分离培养及其生物学特性的探讨［J］.实用口腔医学杂志,1994（3）:189-191.

　　［9］汤楚华,施生根.酶消化组织块法原代培养人牙周膜成纤维细胞的初步研究［J］.中华医学杂志,2004（8）:656-658.