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大孔吸附树脂分离纯化降香总黄酮的实验研究

文章来源：本站原创    文章作者：admin    日期：2010年12月14日
【摘要】  目的 考察大孔吸附树脂分离纯化降香总黄酮的工艺条件及参数。方法 选择9种不同极性的大孔吸附树脂，以降香总黄酮为指标，通过静态吸附和解吸附试验优选树脂，动态试验考察其纯化降香总黄酮的最佳工艺条件。

【摘要】  目的 考察大孔吸附树脂分离纯化降香总黄酮的工艺条件及参数。方法 选择9种不同极性的大孔吸附树脂，以降香总黄酮为指标，通过静态吸附和解吸附试验优选树脂，动态试验考察其纯化降香总黄酮的最佳工艺条件。结果 静态试验选出HPD100树脂，其最佳静态吸附时间和解吸附时间均为5 h，样品溶液浓度为3.7 mg/mL，吸附流速为2 mL/min，10倍床体积的70%以上浓度乙醇洗脱，可解吸附70%的降香总黄酮。结论 HPD100树脂能够有效纯化降香总黄酮。

【关键词】  降香；总黄酮；大孔吸附树脂；分离纯化

  Abstract:Objective To study the purification process of total flavonoids in Lignum Dalbergiae odoriferae with macroporous resin. Methods 9 kinds of macroporous resins with different polarities were used in the purification of the total flavonoids in Lignum Dalbergia odorifera.Results  HPD100 macroporous resin was better in purification of the total flavonoids. The optimal static adsorbing time and desorbing time were both 5 h, the optimal concentration of sample was 3.7 mg/mL, flow speed was 2 mL/min, and eluted with ethanol at the concentration of more than 70% which volume was ten times of elution bed volume, what was better in eluotropic effect with smaller in tailing level. Conclusion HPD100 macroporous resin could be used in the purification of the total flavonoids in Lignum Dalbergiae odoriferae. The adsorption quantity of total flavonoids at saturation was 24.983 mg/g。

    Key words: Lignum Dalbergiae odoriferae; total flavonoids; macroporous resin; purification

   降香Lignum Dalbergiae odoriferae为豆科植物降香檀Dalbergia odorifera T.Chen的树干和根的干燥心材［1］。降香中主要含有挥发油和黄酮类成分，以黄酮类成分的含量较高，具有抗炎、镇痛、抗氧化、中枢神经作用及心血管方面的作用［2］。

    　　大孔吸附树脂具有良好的吸附性能，应用日趋广泛，在天然药物化学成分的分离与富集研究中被广泛应用［3］。本课题组对大孔树脂纯化降香总黄酮进行了初步研究［4］，本实验选取文献报道对分离黄酮类化合物作用较好的9种树脂，考察其对降香总黄酮的吸附情况，优选出最佳的精制工艺。

    1  仪器与试药

    　　UV2450紫外可见分光光度仪（SHIMADZU）；电子分析天平（BP211D）；降香药材（广州市药材公司，产地海南）；柚皮素对照品（实验室自制，经UV、1HNMR鉴定结构，HPLC检测、面积归一化法计算，纯度大于98%）；HP20、HPD100、YWD01、NKAⅡ、D140、NKA9、 DA201、 AB8、 S8等9种树脂的生产厂家及主要参数见表1；化学试剂均为分析纯。

    2  方法与结果

    2.1  样品的提取及总黄酮含量测定方法

    2.1.1  样品溶液的制备  称取50 g降香药材粗粉，90 ℃下用10倍量体积分数70%的乙醇提取 树脂生产厂家极性平均孔径/nm比表面积/(m2·g-1)HP20日本三菱化成非极性460600HPD100河北沧州宝恩化工有限公司非极性8.5～9.0650～700YWD01河北沧州远威化工有限公司非极性10500D140成都晨光化工研究院非极性9.5500～600DA201华东理工大学华昌聚合物有限公司非极性90～100450～500AB8南开大学化工厂弱极性130～140480～520NKAII南开大学化工厂极性145～155160～200NKA9南开大学化工厂极性155～165250～290S8南开大学化工厂极性280～300100～120

    2.1.2  标准曲线的制备  精密称取柚皮素对照品0.001 43 g，用体积分数70%的乙醇溶解并定容至50 mL备用。分别精密吸取对照品溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL于10 mL容量瓶内，准确加入1 mL甲醇钠，用体积分数70%的乙醇定容至刻度，摇匀，放置40 min，在410 nm处测定其吸光度。计算得回归方程为Y=3.2422X-0.0193，r=0.999 8，线性范围是0.014 3～0.085 9 mg。

    2.1.3  样品中总黄酮含量的测定方法  精密吸取待测样品溶液0.1 mL稀释至5 mL，再吸取1 mL稀释液于10 mL容量瓶，准确加入1 mL甲醇钠，用体积分数70%的乙醇定容至刻度，摇匀，放置40 min，在410 nm处测定其吸光度，代入回归方程计算总黄酮含量［5］。

   2.2  树脂的预处理

   树脂先用乙醇浸泡24 h，充分溶胀。湿法装柱，用体积分数95%的乙醇洗柱至流出液加水不出现白色混浊，用水洗尽乙醇。再用质量分数5%的HCl溶液对树脂柱进行酸洗，用水洗至中性。然后用质量分数5%的NaOH溶液碱洗，水洗至中性，即可。

 2.3  树脂类型的筛选

    2.3.1  静态吸附和解吸附试验  准确称取预处理的树脂2 g于具塞的磨口锥形瓶中，精密加入总黄酮质量浓度为3.937 mg/mL的降香提取液30 mL，室温25 ℃下振荡(110 r/min) 吸附24 h至平衡，过滤，取0.1 mL按“2.1.3”项下测定其吸光度并计算总黄酮含量。将上述吸附已达饱和的各树脂分别加入适量蒸馏水洗涤，再加入体积分数70%的乙醇30 mL进行洗脱，室温25 ℃下振荡(110 r/min) 24 h，测定洗脱液中总黄酮含量。按下列公式计算吸附和解吸附数据：

    比吸附量(mg·g-1)=(C0-Ce)×V/m    

    比解吸量(mg·g-1)=C1V/m

    解吸附率(%)=比解吸量/比吸附量×100%

    其中，C0为起始浓度，Ce为平衡浓度，V为溶液体积，m为树脂质量，C1为解吸液浓度。

    结果见表2。表2  大孔吸附树脂静态吸附解吸试验结果

    综合各树脂的吸附量和解吸率，选取HP20、HPD100、NKA9、AB8 4种树脂进行静态吸附和解吸附的动力学曲线考察。

    2.3.2  静态吸附和静态解吸附动力学曲线  　　准确称取预处理的各树脂2 g于具塞的磨口锥形瓶中，精密加入黄酮质量浓度为3.937 mg/mL的降香提取液30 mL，室温25 ℃下振荡(110 r/min)进行吸附，在0.5、1、2、3、4、5、12、18、24 h时吸取上清液，测定样品中的总黄酮含量，计算在t时刻内各树脂对降香总黄酮的吸附量，以吸附量对t作图，得到各树脂的吸附动力学曲线，见图1。

    　　将吸附24 h后的树脂过滤后用蒸馏水冲洗，加入体积分数70%的乙醇30 mL进行洗脱，室温25 ℃下振荡(110 r/min)，在0.5、1、2、3、4、5、12、18、24 h时吸取上清液，测定溶液中的总黄酮含量，计算在t时刻内各树脂的解吸量，以解吸量对t作图，得到各树脂的解吸动力学曲线，见图2。

    综合各树脂的静态吸附和解吸附的动力学曲线，HPD100树脂吸附量和解吸量较高，在5 h内吸附和解吸附高于其他树脂，故选用HPD100大孔吸附树脂做进一步考察。

    2.4  HPD100树脂的纯化工艺参数选择

    　　考察上柱液的流速、黄酮浓度等因素对树脂吸附性能的影响，确定最佳的吸附工艺条件。对已吸附样品的树脂用不同浓度的乙醇进行动态解吸附实验，考察不同浓度乙醇对树脂解吸附性能的影响，测定每1倍床体积的解吸量，绘制动态解吸曲线。

    2.4.1  药液浓度对吸附量的影响  将降香黄酮提取液稀释成不同质量浓度，各取30 mL于具塞三角瓶中，各加入HPD100树脂2 g，室温25 ℃下振荡(110 r/min) 吸附5 h，过滤，取0.5 mL溶液定容至5 mL，再取0.1 mL按“2.1.3”项下测定其吸光度并计算总黄酮含量。结果见表3。表3  不同药液浓度对吸附量的影响从表3可知，在低浓度下，随着降香提取液的浓度增加，树脂吸附率增大；在质量浓度为3.7 mg/mL时，树脂具有最大吸附量；溶液浓度大于4.0 mg/mL，树脂吸附率反而下降。因此，降香黄酮提取液的初始浓度以3.7～4.0 mg/mL为宜。

    2.4.2  流速对吸附量的影响  将吸附流速分别控制为2、4、6、8 mL/min进行动态吸附，流速对吸附量的影响见表4。从表中可看出，降香提取液的流速是影响树脂吸附性能的重要因素之一。当流速超过2 mL/min时，树脂的吸附量明显下降。因此，控制流速2 mL/min较理想。表4  流速对吸附量的影响

    2.4.3  洗脱剂浓度的影响  取吸附饱和的HPD100大孔树脂(总黄酮吸附量为24.983 mg/g)，选择不同浓度的乙醇水溶液作为洗脱剂，考察其解吸率，结果见表5。结果显示，体积分数70%以上的乙醇水溶液解吸附效果较好，达到了将近70%的解吸率，当解吸液的浓度达到95%时，降香黄酮的解吸率最高可达97.86%。表5  洗脱剂浓度对解吸率的影响

    2.4.4  洗脱剂用量的影响  取吸附饱和的HPD100大孔树脂(24.983 mg/g)，用不同醇浓度的乙醇水溶液进行洗脱，分段收集每1倍床体积洗脱液，并测定其吸收度，以N倍床体积为横坐标，收集液中降香总黄酮的洗脱量为纵坐标绘制树脂解吸曲线，通过解吸曲线确定洗脱剂乙醇用量，结果见图3。　　由洗脱曲线可知，10倍床体积的洗脱液基本可以将降香黄酮洗脱下来，且已醇体积分数为70%以上的洗脱液洗脱较完全，拖尾现象程度较轻，故应用10倍床体积、体积分数高于70%乙醇洗脱较好。

    3  结 论

    　　HPD100大孔吸附树脂对降香总黄酮的吸附和解吸附有较好的效果，能够有效的纯化降香总黄酮。在本实验条件下，最佳静态吸附时间和解吸附时间均为5 h，上柱样品溶液质量浓度为3.7 mg/mL，吸附流速为2 mL/min，体积分数大于70%的乙醇溶液洗脱效果较好，洗脱的拖尾程度较小，吸附饱和时降香总黄酮的吸附量为24.983 mg/g。

    4  讨 论

    　　大孔吸附树脂的性质不同程度地影响着其分离纯化效果。树脂的极性（功能基）是影响吸附性能的重要因素［6］。本文选取极性、弱极性、非极性3种类型的树脂为吸附材料，初步研究了树脂对降香黄酮的吸附、解吸附特性。从表2可以看出，极性大的S8树脂吸附量最大，这主要是由于黄酮类化合物具有酚羟基和糖苷键，具有一定的极性和亲水性，根据相似相容原理，黄酮类化合物易被极性树脂吸附。

    　　但是，从试验结果来看，其精制效果并非极性越大越好，如极性大的S8树脂吸附量最大，但它的解吸率仅仅为36.87%，在所选材料中解吸率最低，这在生产中是极为不利的。树脂的空间结构（平均孔径、比表面积）也是影响树脂吸附效果的重要参数［6］，大孔树脂吸附原理主要为物理吸附，所以比表面积越大，表面张力越大,吸附量越高，更有利于吸附。从表2可以看出，虽然NKAII、NKA9为极性树脂，但其吸附量仅仅为5.552 mg/g、5.860 mg/g，在9种吸附材料中吸附量最小，而非极性的HPD100、D140却具有较大的吸附量。这主要是由于NKAII、NKA9树脂的比表面积远小于非极性的HPD100、D140树脂，减弱了树脂对黄酮类化合物的吸附能力，所以NKAII、NKA9树脂并不适合于作降香黄酮的吸附剂。

    　　大孔吸附树脂的吸附过程主要是被吸附物通过树脂孔径进入树脂内部，被树脂的内表面吸附，所以除了比表面积外，树脂的孔径对吸附效果影响也很大，只有合适的孔径，被吸附物才能自由而且有选择性的进入树脂，提高树脂的吸附量，达到最佳吸附效果［6］。通过分析9种树脂对降香黄酮的吸附特性，综合考虑吸附量、吸附率、解吸率和吸附动力学等多方面因素，可以看出，HPD100树脂对降香黄酮吸附量大，而且解吸附较容易，这可能与HPD100树脂同降香黄酮有相匹配的孔径、孔容、极性及比表面积有关。所以，HPD100树脂是一种性能良好的降香黄酮吸附剂，可作为制备高纯度的降香总黄酮的理想填料。

【参考文献】
  ［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部［S］.北京：化学工业出版社,2005:158-159.

［2］ ZHAO Q,GUO J,ZHANG Y.Chemical and pharmacological research progress of Chinese drug “JiangXiang”(Lignum Dalbergiae odoriferae) ［J］. J Chn Pharm Sci,2000, 9(1):1-5.

［3］ 吴立军.天然药物化学［M］.北京：科学技术文献出版社,2006:15.

［4］ 黄丽容，陆金环，谭健星，等. AB8大孔吸附树脂纯化降香总黄酮的工艺研究［J］.广东药学院学报，2006，22（3）：270-271.

［5］ 郭丽冰，王蕾. 降香总黄酮含量测定方法的研究 ［J］.中药材,2008,31(5):68-71.

［6］ 何伟，李伟.大孔树脂在中药成分分离中的应用［J］.南京中医药大学学报，2005,21(2):134-136.

 

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