加味补肝汤对糖尿病大鼠坐骨神经中蛋白激酶Cβ亚型表达的影响

【摘要】  目的 观察加味补肝汤对糖尿病大鼠坐骨神经中蛋白激酶Cβ亚型(PKC-βⅡ)mRNA表达的影响,探讨其对实验性糖尿病大鼠周围神经病变的防治作用。方法 65只大鼠适应性喂养1周后,随机取20只为正常组,45只造模,以链脲佐菌素诱发糖尿病模型,将造模成功后的40只大鼠随机分为模型组、加味补肝汤组。分别于治疗后4、8周处死大鼠,用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术测定坐骨神经中PKC-βⅡ mRNA的表达。结果 治疗后4、8周模型组大鼠PKC-βⅡ mRNA表达明显高于正常对照组(P＜0.05),加味补肝汤组PKC-βⅡ mRNA表达明显低于同期模型组(P＜0.05)。结论 加味补肝汤对实验性糖尿病大鼠周围神经病变有一定的防治作用。

【关键词】  加味补肝汤；糖尿病；坐骨神经；蛋白激酶Cβ亚型；大鼠

    Abstract：Objective To observe the effect of Jiawei Bugan decoction on PKC-βⅡ expression of sciatic nerve in experimental diabetic rat and explore its preventive and therapeutic effects on peripheral neuropathy in experimental diabetic rats. Methods In 65 rats involved, 45 rats were made as model and 20 were used as control. The diabetic rat model was established by streptozotocin (STZ). Forty model rats were randomly divided into model group and Jiawei Bugan decoction group. The rats were killed on 4th or 8th week from the beginning of treatment respectively, and PKC-βⅡ mRNA of sciatic nerve was detected by reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). Results PKC-βⅡ expression of the model group on 4th or 8th week was higher than that of the normal control group (P＜0.05), while that of Jiawei Bugan decoction group were markedly lower than the model group (P＜0.05). Conclusion Jiawei Bugan decoction has preventive and therapeutic effect on peripheral neuropathy in experimental diabetic rats.
   
　　Key words：Jiawei Bugan decoction；diabetes；sciatic nerve；protein kinase c-βⅡ；rat
 
    糖尿病周围神经病变(DNP)是目前糖尿病患者致残的主要原因。大量研究表明,蛋白激酶C信号传导通路与糖尿病微血管并发症发生相关,尤其与蛋白激酶Cβ亚型(PKC-βⅡ)关系更为密切[1]。目前已阐明,该通路在糖尿病视网膜病变及肾病发展中起重要作用[2],但糖尿病神经组织中的情况仍存在争议。为此,笔者观察了PKC-βⅡ在实验性糖尿病大鼠2个月坐骨神经的表达变化情况及中药汤剂加味补肝汤对其的影响,探讨其对实验性糖尿病大鼠周围神经病变的防治作用。

　　1  实验材料

　　1.1  动物

    8周龄清洁级健康雄性Wistar大鼠65只,体重250～280 g,上海斯莱克实验动物有限责任公司提供,许可证号SCXK(沪) 2003-003。

　　1.2  药物

    加味补肝汤(枸杞子15 g,木瓜15 g,当归10 g,川芎10 g,熟地黄12 g,白芍15 g,桑寄生15 g,麦冬15 g,花粉15 g),中药饮片由中南大学湘雅医院药剂科提供。中药饮片加水300 mL,浸泡30 min,水煎40 min,第2次煎时加水200 mL,煎煮20 min,取煎汁,混匀,水浴浓缩成每1 mL含2.72 g原药材的药液。

　　1.3  仪器

    TC-512型PCR仪(英国TECHNE公司)；血糖仪(德国罗氏公司ACCU-CHEK)；Motic2000图像分析仪；MS302多媒体生物信号记录分析系统(广州中医药大学)。

　　1.4  试剂

    琼脂糖(北京鼎国公司)；溴化乙锭、链脲佐菌素(美国Sigma公司)；Trizol(MRC公司)；反转录(RT)试剂盒(美国MRI公司)；Pre Mix Taq(宝生物大连有限公司)；引物由上海生工生物技术有限公司合成；其他常规试剂由湘雅医院药剂科提供。

　　2  实验方法

　　2.1  分组

    65只大鼠适应性喂养1周后,随机取20只为正常组,45只造模,将造模成功后的40只大鼠随机分为模型组20只,加味补肝汤实验组20只。2组血糖值比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

　　2.2  造模及给药

    参照文献[3]方法。造模前禁食12 h,一次性腹腔注射1%链脲佐菌素(50 mg/kg,0.1 mol/L柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液配制而成,pH4.2～4.5)诱发糖尿病,72 h后用血糖仪测定尾尖血血糖,凡血糖＞16.7 mmol/L为造模成功,造模不成功的大鼠按上述方法重复1次。正常组20只大鼠禁食12 h后一次性腹腔注射相等容积0.1 mol/L的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液。

　　2.3  血糖测定

    尾静脉取血,采用葡萄糖氧化酶法,罗氏公司ACCU-CHEK血糖仪及试纸条测定。

　　2.4  神经电生理检测

    参照文献[4]方法并略加改进,分别于治疗后4、8周末进行神经电生理检测。大鼠一次性腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg),麻醉后俯卧固定,刺激电极置于坐骨切迹(刺激强度2.0 mV,刺激波宽3.0 ms),在踝部(远端)和右足二趾间分别插入记录电极,参考电极置于记录电极和刺激电极之间,并连接计算机MS302多媒体生物信号记录分析系统,记录远近端坐骨神经产生动作电位的潜伏期,测定两记录电极间的距离,神经传导速度为记录电极之间的距离/动作电位潜伏期之差。测定时保持被检测肢体温度在37 ℃左右。

2.5  标本收集

    分别于治疗后4、8周一次性腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉,俯卧位固定,取左侧梨状肌下缘坐骨神经约1 cm,置于液氮中,-80 ℃保存,用于mRNA检测。

　　2.6  反转录-聚合酶链反应
   
　　①引物合成：用Primer Premier 5.0软件设计引物,由上海生工生物技术有限公司合成(见表1)。表1  目的基因扩增引物序列（略）
  
   ②组织总RNA提取：采用Trizol提取总RNA。按Trizol试剂说明书提取总RNA,溶解于20 μL DEPC处理灭菌双蒸水,经2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性,并测定A260/A280比值在1.8～2.0之间,说明RNA样品纯度理想；于-70 ℃冻存。

    ③反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)：cDNA的合成按照反转录试剂盒说明书进行操作：总RNA 2 μL(约0.5 μg),Oligo(dT) l8(50 μg/mL)1 μL,RNasin 1 μL,加EDPC水至11 μL,70 ℃, 5 min；冰上骤冷30 s,加5×Rtbuffer 4 μL,10 mmol/L dNTPMix 2 μL,RNasin 1 μL,加EDPC水至19 μL,37 ℃,5 min；加M-Mulv反转录酶(200 U/μL)1 μL,总体积20 μL,42 ℃,60 min；70 ℃, 10 min。

    PCR反应体系：cDNA产物2 μL,Pre Mix Taq 12.5 μL, 10 μmol/L目的引物1 μL,β-actin引物1 μL,加DEPC水至25 μL,4 000 r/min短暂离心,于PCR仪扩增。扩增反应：94 ℃预变性5 min,94 ℃变性40 s,56.2 ℃退火40 s,72 ℃延伸45 s,32个循环,最后72 ℃延伸7 min。

    ④产物分析：取5 μL反应产物,2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,Eagle EyeⅡ图像处理系统拍照。

    用Bandleader Ver3.0软件将PKC-βⅡ扩增产物的光密度值与β-actin扩增产物光密度值的比值作为表达水平的参数,进行半定量分析。

　　3  统计学方法

    计量资料以x±s表示,采用SPSS13.0软件进行统计分析。采用方差分析,如方差齐用LSD法,方差不齐则用Dunnett T3法。

　　4  结果

　　4.1  一般情况

    实验过程中,模型组大鼠死亡4只,加味补肝汤组死亡3只,均在补充实验中补齐到20只。

    连续给药后,模型组在链脲佐菌素注射72 h后逐渐出现多尿、多饮、多食、毛竖无光泽、蜷卧拱背等症状；加味补肝汤组也有类似表现,但程度较模型组轻。

　　4.2  各组大鼠坐骨神经传导速度的测定

　　(见表2)  表2  各组大鼠坐骨神经传导速度比较(略)注：与同期正常组比较,*P＜0.05；与同期模型组比较,#P＜0.05；与同组前一个时间点比较,△P＜0.05(下同)

　　4.3  各组大鼠坐骨神经中蛋白激酶Cβ亚型mRNA的表达
   
　　各组RT-PCR电泳结果显示：模型组治疗4、8周时,PKC-βⅡ mRNA表达(PKC-βⅡmRNA/β-actin mRNA相对吸光度值比)显著增加,随病程延长PKC-βⅡ mRNA含量进一步增加,加味补肝汤干预后PKC-βⅡ mRNA表达水平均明显低于同期模型组(P＜0.05),但明显高于正常组(P＜0.05)。提示加味补肝汤对糖尿病大鼠坐骨神经PKC-βⅡ mRNA表达有下调作用。见表3及图1、图2。  表3  各组大鼠坐骨神经中PKC-βⅡ mRNA含量半定量的比较(略)
 
　　5  讨论
    
　　PKC-βⅡ是经典PKC家族亚型之一,激活时需要依赖Ca2+、二酰基甘油(DG)和磷脂酰丝氨酸(PS)或佛波酯(PMA),已有研究显示,高血糖可激活肾脏PKCα、βⅠ、βⅡ、δ、ε,且优先激活PKC-βⅡ。另有研究报道,实验性糖尿病大鼠模型心脏和主动脉PKC-βⅡ特异性升高[5]。用免疫印迹技术发现,在糖尿病大鼠主动脉及心脏组织中及与高糖培养的主动脉平滑肌细胞中PKC-β、γ亚型优先被激活[6]。PKC-βⅡ亚型参与了糖尿病视网膜、主动脉、心脏、肾脏病变的发生发展,在糖尿病微血管并发症中已显示了极其重要的地位。

　　同样,PKC信号传导通路对糖尿病微血管病变之一的糖尿病周围神经病变发生具有重要意义。PKC丰富存在于中枢神经系统及周围神经系统中的传入、传出神经,参与许多生理活动如神经递质释放、细胞增殖分化等,它是许多外在刺激因子如激素、神经递质、生长因子等发挥作用的重要信号调节因子[7-8]。

　　本实验观察到,正常Wistar大鼠的坐骨神经中PKC-βⅡ mRNA仅少量表达,而模型对照4、8周时,PKC-βⅡ mRNA表达出现显著增加,随病程延长PKC-βⅡ mRNA含量进一步增加。PKC-βⅡ表达上调可影响一系列血管功能,包括血管舒缩反应、血管通透性、内皮细胞生长增殖、新生血管形成以及血液流变学等,并影响细胞外基质蛋白(ECM)变化,血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子β(TGF-β)基因表达等,这些生物效应均参与了糖尿病神经病变的发病过程。而加味补肝汤干预后, PKC-βⅡ mRNA表达水平均明显低于模型组(P＜0.05),提示加味补肝汤能抑制糖尿病大鼠坐骨神经PKC-βⅡ mRNA的过度表达,从而起到保护周围神经作用。
   
　　加味补肝汤出自《医宗金鉴》一书,是滋养肝血的代表方剂。经现代药理研究表明,具有改善血液流变性及微循环作用,从而起到改善缺血缺氧状态。根据本实验研究结合现代方剂、药理研究推测,加味补肝汤通过有效抑制PKC-βⅡ的激活和表达上调,改善了PKC信号传导通路对周围神经的不良影响,从而对糖尿病周围神经病变起到有效的防治作用。

【参考文献】
  　　[1] 朱邦豪,关永源.糖尿病合并症与蛋白激酶C[J].中国药理学报,2000, 16(1)：6.

　　[2] Nakamura J, Kato K, Hamada Y, et al. A protein kinase c-Beta- selective inhibitor ameliorates neural dysfunction in streptozotocin- induced diabetic rats[J]. Diabetes,1999,48(10)：2090.

　　[3] Schmeichel AM, Schmelzer JD, Low PA. Oxidative injury and apoptosis of dorsal root ganglion neurons in chronic experimental diabetic neuropathy[J]. Diabetes,2003,52(1)：165－171.

　　[4] Yagihashi S, Kamijo M, Ido Y, et al. Effects of long-term aldose reductase inhibition on development of experimental diabetic neuropathy：ultrastructural and morphometric studies of sural nerve in streptozotocin-induced diabetic rat[J]. Diabetes,1990, 39：690－696.

　　[5] Inoguchi T, Battan R, Handler E, et al. Preferential elevation of protein kinase C isoformβⅡ and diacyglycerol levels in the aorta and heart of diabetic rats：Differential reversibility to glycemic control by islet cell transplantation[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1992,89：11059－11063.

　　[6] Kunisaki M, Bursell SE, Umeda F, et al. Normalization of cylglycerol protein kinase C activation by vitamin E in aorta of diabetic rats and cultured rat smooth muscle cells exposed to elevated glucose levels[J]. Diabetes,1994,43：1372－1377.

　　[7] Rosin MP, Barbin G. Differential expression of PKC isoforms in hippocampal neuronal cultures：modifications after basic FGF treatment[J]. Neurochem Int,1997,30(3)：261－270.

　　[8] Plet A, Gerbaud P, Anderson WB, et al. Effect of phorbol ester on cyclic adenosine 3’,5’-monophosphate-dependent protein kinases in PYS teratocarcinoma-derived cells and counteraction with retinoic acid[J]. Cacer Res,1988,48(14)：3993－3997.